栽培用キャベツ及びカリフラワー種子における遺伝子組換え体の検査法

1．概要

本検査法は、アブラナ科のキャベツ及びカリフラワーの種子を検査対象とする。DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用い、1検体から2反復でDNAを抽出精製する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2．検査法

栽培用キャベツ及びカリフラワー種子における遺伝子組換え体の検査法(PDF : 231KB)

3．個別事項の説明

検査対象

和名：キャベツ
学名：Brassica oleracea L. var. capitata

和名：カリフラワー
学名：Brassica oleracea L. var. botrytis

DNA抽出精製

QIAGEN社のDNeasy Plant Mini Kitを使用。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	サイズ	遺伝子配列
1	アブラナ科内在性遺伝子検知用 (内在性遺伝子検出用)	CruA	101bp	F^(注)：GGC CAG GGT TTC CGT GAT R：CCG TCG TTG TAG AAC CAT TGG P：FAM- AGT CCT TAT GTG CTC CAC TTT CTG GTG CA -TAMRA
2	T-Nos検知用 (組換え体由来遺伝子検出用)	T-Nos	151bp	F：GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG R：CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T P：FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA
3	NPTII検知用 (組換え体由来遺伝子検出用)	NPTII	786bp	F：GAC AGG TCG GTC TTG ACA AAA AG R：GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC P：FAM- CCC TGC GCT GAC AGC CGG A -TAMRA

(注) F: フォワードプライマー、R: リバースプライマー、P: プローブ

使用PCR機器及び反応条件

1）検査法の開発・確立に使用したPCR機器

ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus（いずれもアプライドバイオシステムズ社）

2）反応条件

50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 45cycles

3）PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix

妥当性確認

7試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関には各GM濃度につき16点、2作物計64点のブラインド試料を配付。

1）キャベツ

GM濃度(%)	試料数	正答率(%)^(注1)	誤答率(%)^(注2)
0.5%	112	100	0
0%	112	100	0

2）カリフラワー

GM濃度(%)	試料数	正答率(%)	誤答率(%)
0.5%	112	98	2
0%	112	99	1

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、0.5%の試料については陽性と判断した比率を示す。

(注2) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、0.5%の試料については偽陰性率を示す。

検出限界

0.5%

農林水産省事業名

検査手順作成：平成24年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業

（栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業）

共同試験：平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業

（栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業）

References

1. Biotechnology & GMOs Unit Institute for Health and Consumer Protection DG Joint Research Centre 07, February 2007

M.Mazzara, E.Grazioli, C.Savini and G.Van den Eede

"Event-specific Method for the Quantification of Oilseed Rape Line RT73 Using Real-time PCR"

2. Journal of AOAC International, Volume 85, Number 5, September 2002, p. 1077-1089 (13)

Kuribara.H, Shindo.Y, Matsuoka.T, Takubo.K, Futo.S, Aoki.N, Hirao.T, Akiyama.H, Goda.Y, Toyada.M, Hino.A

"Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean."

3. Journal of Agricultural and food Chemistry, 2009, 57(1), p.26-37

Mano.J, Shigemitsu.N, Futo.S, Akiyama.H, Teshima.R, Hino.A, Furui.S, and Kitta.K

"Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan."

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課
担当者：組換え体管理指導班
代表：03-3502-8111（内線4510）
ダイヤルイン：03-6744-2102

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