栽培用アルファルファ種子における遺伝子組換え体の検査法
1. 概要
本検査法は、栽培用アルファルファの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。
2. 検査法
3. 個別事項の説明
検査対象
和名:アルファルファ
学名:Medicago sativa L.
DNA抽出精製
ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。
PCRプライマー対及びプローブ
名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列(注) | |
1 | NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ[1] | NOS ter | 151bp | TNOS-F:5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG -3’ TNOS-R:5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’ TNOS-P:FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA |
2 | PFMVプロモーター配列検知プライマー対・プローブ[1] | PFMV | 120bp | PFMV-F:5’- ATC AAC AAG GTA CGA GCC ATA TC -3’ PFMV-R:5’- TGA GGC TTT GGA CTG AGA ATT C -3’ PFMV-P:FAM 5’- CCA AGA AGG AAC TCC CAT CCT CAA AGG TTT -3’ TAMRA |
3 | アルファルファ内在性ACC1遺伝子配列検知プライマー対・プローブ[2] | ACC1 | 91bp | ACC1-F:5’- GAT CAG TGA ACT TCG CAA AGT AC -3’ ACC1-R:5’- CAA CGA CGT GAA CAC TAC AAC -3’ ACC1-P:FAM 5’- TGA ATG CTC CTG TGA TCT GCC CAT GC -3’ TAMRA |
使用したPCR機器及び反応条件
1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器
Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems 社)
2)反応条件
50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles
3)PCR試薬
Taqman Universal PCR Master Mix
妥当性確認
8試験機関による共同試験を実施。
1試験機関においては、3種類(GM濃度0%、0.05%及び0.1%)の試料を、1濃度につき7点分析。
GM濃度(%)(注1) | 試料数 | 正答率(%)(注2) | 誤答率(%)(注3) |
0.5% | 56 | 100% | 0% |
0.1% | 48 | 81.3% | 18.8% |
0% | 56 | 100% | 0% |
(注1)NOSターミネーターが導入された認証標準物質(MON88017 トウモロコシ)を該当濃度含有する。
(注2)GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注3)GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。
検出下限
0.5%
農林水産省事業名
- 平成27年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)
- 平成28年度 栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備及び確立事業)
参考資料
[1]Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui
and Kazumi Kitta,
Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its
Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1), 26-37
[2]Treyor W. Alexander, Tim Reuter, and Tim A. McAllister,
Qualitative and Quantitative Polymerase Chain Reaction Assays for an Alfalfa (Medicago sativa)-Specific
Reference Gene To Use in Monitoring Transgenic Cultivars
Jounal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(8), 2918-2922
お問合せ先
消費・安全局農産安全管理課
担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102