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農林水産省

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栽培用トールフェスク種子における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法は、栽培用トールフェスクの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2. 検査法

3. 個別事項の説明

検査対象

和名:トールフェスク
学名:Festuca arundinacea Schreb.

DNA抽出精製

QIAGEN社のDNeasy Plant Mini kitを使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

  名称 標的遺伝子 サイズ 遺伝子配列(注)
1 35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ[1] P35S  101bp P35S-F:5’- ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T -3’

P35S-R:5’- CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T -3’

P35S-P:FAM 5’- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -3’ TAMRA
2 NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ[1] NOS ter  151bp TNOS-F:5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3’

TNOS-R:5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’

TNOS-P:FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA
3 植物共通遺伝子配列検知プライマー対・プローブ[1] 18S rRNA  111bp 18S rRNA-F:5’- TGT TGG CCT TCG GGA TCG GGA TCG GAG TA-3’

18S rRNA-R:5’- GCT TTC GCA GTT GTT CGT CTT TCA-3’

18S rRNA-P:FAM 5’- TCG GGG GCA TTC GTA TTT CAT AGT CAG A -3’ TAMRA
(注)F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ


使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5(Thermo Fisher Scientific 社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 


妥当性確認

8試験機関による共同試験を実施。
1試験機関においては、3種類(GM濃度0%、0.5%及び1%)の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度(%)(注1) 試料数 正答率(%)(注2) 誤答率(%)(注3)
1% 56 100% 0%
0.5% 56 100% 0%
0% 56 100% 0%   

(注1)35Sプロモーターが導入された認証標準物質(MON88017 トウモロコシ)を該当濃度含有する。

(注2)GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

(注3)GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限


0.5%

農林水産省事業名

  • 平成29年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業(栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

参考資料

[1]Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui and Kazumi Kitta,
    Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its Application in Identifying
    Unapproved Genetically Modified Crops in Japan 
    Journal of Agricultural and Food Chemistry2009, 57(1), 26-37

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102

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