栽培用ワタ種子における遺伝子組換え体の検査法
1.概要
本検査法は、ワタの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。
2.検査法
栽培用ワタ種子における遺伝子組換え体の検査法(PDF:223KB)
3.個別事項の説明
検査対象
和名:ワタ
学名:Gossypium hirsutum L.
DNA抽出精製
ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。
PCRプライマー対及びプローブ
名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列 | |
1 | ワタSAH7遺伝子配列検知プライマー対・プローブ | Sah7 | 115bp |
F(注):AGT TTG TAG GTT TTG ATG TTA CAT TGA G R:GCA TCT TTG AAC CGC CTA CTG P:FAM- AAA CAT AAA ATA ATG GGA ACA ACC ATG ACA TGT -TAMRA |
2 | 35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ | P35S | 101bp |
F:ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T R:CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T P:FAM- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -TAMRA |
3 | NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ | NOS ter | 151bp |
F:GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG R:CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T P:FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA |
(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ
使用PCR機器及び反応条件
1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器
ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus(いずれもアプライドバイオシステムズ社)
2)反応条件
50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 45cycles
3)PCR試薬
Taqman Universal PCR Master Mix
妥当性確認
8試験機関にて実施。
GM濃度(%) | 試料数 | 正答率(%)(注1) | 誤答率(%)(注2) |
0.5% | 56 | 100% | 0% |
0.1% | 56 | 100% | 0% |
0% | 56 | 100% | 0% |
(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、0.1及び0.5%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、0.5%の試料については偽陰性率を示す。
検出下限
0.1%
農林水産省事業名
検査手順作成:平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)
共 同 試 験 :平成26年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業(ナス等検証試験参画))
References
1 JRC Compendium of Reference Methods for GMO analysis
Mazzara.M, Larcher.S, Savini.C, Charles Delobel.C, and Van Den Eede.G
"Event-Specific Methods for the Quantitation of the Hybrid Cotton Line 281-24-236/3006-210-23 Using Real-Time PCR - Validation Report and Protocol - DNA Extraction Cotton Seeds"
2,3 Journal of AOAC International, Volume 85, Number 5, September 2002, pp. 1077-1089(13)
Kuribara.H, Shindo.Y, Matsuoka.T, Takubo.K, Futo.S, Aoki.N, Hirao.T, Akiyama.H, Goda.Y, Toyada.M, Hino.A
"Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean."
お問合せ先
消費・安全局農産安全管理課
担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102