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農林水産省

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栽培用アルファルファ種子における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法は、栽培用アルファルファの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2. 検査法


3. 個別事項の説明

検査対象

和名:アルファルファ
学名:Medicago sativa L.



DNA抽出精製

ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

  名称 標的遺伝子 サイズ 遺伝子配列(注)
1 NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ[1] NOS ter 151bp TNOS-F:5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG -3’

TNOS-R:5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’

TNOS-P:FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA
2 PFMVプロモーター配列検知プライマー対・プローブ[1] PFMV 120bp PFMV-F:5’- ATC AAC AAG GTA CGA GCC ATA TC -3’

PFMV-R:5’- TGA GGC TTT GGA CTG AGA ATT C -3’

PFMV-P:FAM 5’- CCA AGA AGG AAC TCC CAT CCT CAA AGG TTT -3’ TAMRA
3 アルファルファ内在性ACC1遺伝子配列検知プライマー対・プローブ[2] ACC1 91bp  ACC1-F:5’- GAT CAG TGA ACT TCG CAA AGT AC -3’

ACC1-R:5’- CAA CGA CGT GAA CAC TAC AAC -3’

ACC1-P:FAM 5’- TGA ATG CTC CTG TGA TCT GCC CAT GC -3’ TAMRA
(注)F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ

使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems 社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 


妥当性確認

8試験機関による共同試験を実施。
1試験機関においては、3種類(GM濃度0%、0.05%及び0.1%)の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度(%)(注1) 試料数 正答率(%)(注2) 誤答率(%)(注3)
0.5% 56 100% 0%
0.1% 48 81.3% 18.8%
0% 56 100% 0%   

(注1)NOSターミネーターが導入された認証標準物質(MON88017 トウモロコシ)を該当濃度含有する。

(注2)GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

(注3)GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限 


 0.5%

農林水産省事業名

  • 平成27年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)
  • 平成28年度 栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備及び確立事業)

参考資料

[1]Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui
    and Kazumi Kitta,
    Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its
    Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan  
    Journal of Agricultural and Food Chemistry2009, 57(1), 26-37
[2]Treyor W. Alexander, Tim Reuter, and Tim A. McAllister,
    Qualitative and Quantitative Polymerase Chain Reaction Assays for an Alfalfa (Medicago sativa)-Specific 
    Reference Gene To Use in  Monitoring Transgenic Cultivars
    Jounal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(8), 2918-2922

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX番号:03-3580-8592

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