栽培用アルファルファ種子における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法は、栽培用アルファルファの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2（ニッポンジーン社）を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2. 検査法

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3. 個別事項の説明

検査対象

和名：アルファルファ
学名：Medicago sativa L.

DNA抽出精製

ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	サイズ	遺伝子配列（注）
1	NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ[1]	NOS ter	151bp	TNOS-F：5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG -3’ TNOS-R：5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’ TNOS-P：FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA
2	PFMVプロモーター配列検知プライマー対・プローブ[1]	PFMV	120bp	PFMV-F：5’- ATC AAC AAG GTA CGA GCC ATA TC -3’ PFMV-R：5’- TGA GGC TTT GGA CTG AGA ATT C -3’ PFMV-P：FAM 5’- CCA AGA AGG AAC TCC CAT CCT CAA AGG TTT -3’ TAMRA
3	アルファルファ内在性ACC1遺伝子配列検知プライマー対・プローブ[2]	ACC1	91bp	ACC1-F：5’- GAT CAG TGA ACT TCG CAA AGT AC -3’ ACC1-R：5’- CAA CGA CGT GAA CAC TAC AAC -3’ ACC1-P：FAM 5’- TGA ATG CTC CTG TGA TCT GCC CAT GC -3’ TAMRA

（注）F：フォワードプライマー、R：リバースプライマー、P：プローブ

使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 （Applied Biosystems 社）

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 

妥当性確認

8試験機関による共同試験を実施。
1試験機関においては、3種類（GM濃度0％、0.05％及び0.1％）の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度（％）（注1）	試料数	正答率（％）（注2）	誤答率（％）（注3）
0.5％	56	100％	0％
0.1％	48	81.3％	18.8％
0％	56	100％	0％

（注1）NOSターミネーターが導入された認証標準物質（MON88017 トウモロコシ）を該当濃度含有する。

（注2）GM濃度が0％の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

（注3）GM濃度が0％の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限 

 0.5％

農林水産省事業名

• 平成27年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業（栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業）
• 平成28年度 栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業（栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備及び確立事業）

参考資料

[1]Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui
    and Kazumi Kitta,
    Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its
    Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan  
    Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1), 26-37
[2]Treyor W. Alexander, Tim Reuter, and Tim A. McAllister,
    Qualitative and Quantitative Polymerase Chain Reaction Assays for an Alfalfa (Medicago sativa)-Specific 
    Reference Gene To Use in  Monitoring Transgenic Cultivars
    Jounal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(8), 2918-2922