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農林水産省

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栽培用ペポカボチャ種子における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法は、本検査法は、ペポカボチャ(ズッキーニ、スクワッシュ又はバターナッツカボチャを含む)の種子を対象とする。GM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2. 検査法


3. 個別事項の説明

検査対象

和名: ペポカボチャ
学名: Cucurbita pepo



DNA抽出精製

ニッポンジーン社GM quicker 2を使用。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

   名称  標的遺伝子  サイズ  遺伝子配列(注)
1 35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ
(組換え体由来遺伝子検出用)[1]
 P35S  101bp F:5’- ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T -3’

R:5’- CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T -3’

P:FAM 5’- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -3’ TAMRA
2 NPTII配列検知プライマー対・プローブ
(組換え体由来遺伝子検出用)[1]
 NPTII  786bp F:5’- GAC AGG TCG GTC TTG ACA AAA AG -3’

R:5’- GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC -3’

P:FAM 5’- CCC TGC GCT GAC AGC CGG A -3’ TAMRA
3 ペポカボチャactin遺伝子配列検知プライマー[2]対・プローブ
(内在性遺伝子検出用)
 actin  91bp F:5’- CCT CTC AAT CCC AAA GCT AAC AG-3’

R:5’- CGG CCT GGA TAG CAA CAT ACA-3’

P:FAM 5’- TGA CAC AAA TCA TGT TTG AAA CTT TTA ATG TAC CTG C-3’ TAMRA
(注)F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ


使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、30秒間 → 58℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 


妥当性確認

8試験機関による共同試験を実施。
1試験機関においては、3種類(GM濃度0%、0.1%及び0.5%)の試料を、1濃度につき7点分析。

 GM濃度(%)(注1)  試料数  正答率(%)(注2)  誤答率(%)(注3)
 0.5%  56  100%  0%
 0.1%  56  100%  0%
 0%  56  100%  0%   

(注1)35Sプロモーターが導入された認証標準物質(MON87460 トウモロコシ)を該当濃度含有する。
(注2)GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注3)GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限


0.1%

農林水産省事業名

  • 平成23年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
    (栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)
  • 平成30年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
    (栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

参考資料

[1]Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui and Kazumi Kitta, 
Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1), 26-37

[2] Ángeles Obrero, Jose V. Die, Belén Román, Pedro Gómez, Salvador Nadal, and Clara I. González-Verdejo, 
Selection of Reference Genes for Gene Expression Studies in Zucchini (Cucurbita pepo) Using qPCR, Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011, 59(10), 5402-5411
   

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102

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