栽培用パパイヤ種子における遺伝子組換え体のスクリーニング検査法

1. 概要

本検査法はパパイヤの種子を対象とする。GM quicker 2（NIPPON GENE社）を用い、1検体から2反復でDNAを抽出する。得られたDNA試料液を、内在性遺伝子検出用プライマーセット及び組換え体由来遺伝子検出用プライマーセットを用いた蛍光LAMPに供し、内在性遺伝子と組換え体由来遺伝子の検出の可否により、遺伝子組換え体の含有の有無を判定する。なお、本検査法は、遺伝子組換え体のスクリーニング検査であることから、遺伝子組換え体陽性と判定した試料は、既存のリアルタイムPCR法を用いた検査法により確定診断を行う。

2. 検査法

• 栽培用パパイヤ種子における遺伝子組換え体のスクリーニング検査法(PDF : 501KB)

3. 個別事項の説明

検査対象

和名： パパイヤ
学名：Carica papaya

DNA抽出精製

GM quicker 2（NIPPON GENE社）

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	遺伝子配列（注）
1	35Sプロモーター配列検知プライマーセット[1]	P35S	P35S-F3：5’- ATT GCG ATA AAG GAA AGG C(C/T)A TCG -3’ P35S-B3：5’- ACT TCC TTA TAT AGA GGA AGG GTC -3’ P35S-FIP：5’- GAA GAC GTG GTT GGA ACG TCT TCT TAG TGG TCC CAA AGA TGG A -3’ P35S-BIP：5’- GCA AGT GGA TTG ATG TGA TAT CTC CTT GCG AAG GAT AGT GGG A -3’ P35S-LoopF：5’- TTT CCA CGA TGC TCC TCG -3’ P35S-LoopB：5’- CGT AAG GGA TGA CGC ACA -3’
2	植物共通遺伝子配列検知プライマーセット[1]	Chy	Chy-F3：5’- TCT ACA ATC TTG CTA ACC CT -3’ Chy-B3：5’- AGT CAT CTT GAG AAT AAC CCA C -3’ Chy-FIP：5’- TGG ATG AAG GGA AAT GGG AGG AGC AAG TAG AGT GAA TGA CAA GA -3’ Chy-BIP：5’- CCA CTC TTG AGA GTT AGC TAG TAT GAG ACA TGT TGC CAA GAA -3’ Chy-LoopF：5’- CGC ATG GGT TTA TAT ACT AGC -3’ Chy-LoopB：5’- ACA ATG GCT ACG ATG AGT TCA -3’

（注）F3：F3プライマー、B3：B3プライマー、FIP：フォワードインナープライマー、BIP：バックワードインナープライマー、LoopF：ループプライマーF、LoopB：ループプライマーB

使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用した機器

Applied Biosystems 7500、Applied Biosystems QuantStudio 5 、Applied Biosystems QuantStudio 12K Flex 、Applied Biosystems StepOne Plus (以上、Thermo Fisher Scientific社)、LightCycler 480 System II（Roche社）

2)反応条件

65℃ 30分間（PCR機器の設定条件例  [65℃、30秒間] × 60cycles）

↓ Ramp rate 1.6℃/s

98℃

↓ Ramp rate：PCR機器のデフォルトの設定

80℃、1分間

↓ Ramp rate：PCR機器のデフォルトの設定

98℃

3)LAMP試薬

Isothermal Master Mix 

妥当性確認

9試験機関による共同試験を実施。
各試験機関においては、3種類（GM濃度0％、0.05％及び0.1％）の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度（％）（注1）	試料数	正答率（％）（注2）	誤答率（％）（注3）
0.1％	63	100％	0％
0.05％	63	98.4％	1.6％
0％	63	98.4％	1.6％

（注1）35Sプロモーターが導入された認証標準物質 ERM-BF412bk Bt11 MAIZE（normal 100% GMO） を該当濃度（w/w）含有する。

（注2）GM濃度が0％の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

（注3）GM濃度が0％の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限

0.05％

農林水産省事業名

• 令和6年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業（栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法確立事業）

参考資料

[1]R. Takabatake, Y. Kagiya, S. Futo, Y. Minegishi, K. Soga, N. Shibata, K. Kondo (2023)
    Rapid Screening Detection of Genetically Modified Papaya by Loop-Mediated Isothermal Amplification.
    Biol. Pharm. Bull., 2023, 46, 713-717.