栽培用ナス及びピーマン種子における遺伝子組換え体の検査法

 1．概要

本検査法は、栽培用ナス及びピーマンの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2（ニッポンジーン社）を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2．検査法

栽培用ナス及びピーマン種子における遺伝子組換え体の検査法（PDF：271KB）

3．個別事項の説明

検査対象

和名：ナス
学名： Solanum melongena L.

和名：ピーマン
学名：Capsicum annuum L.

DNA抽出精製

   ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。

  緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

 

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	サイズ	遺伝子配列
1	ナスβ-fructosidase遺伝子配列検知プライマー対・プローブ	β-fructosidase	141bp	F(注)：CTG CCT CCG TCA AGA TTT GGT CAC T R：CTC TTC CCT TTC TTG ATG G P：FAM- TAA TTC ATC CAA CCA TAT CT -MGB
2	35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ	P35S	101bp	F：ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T R：CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T P：FAM- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -TAMRA
3	NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ	NOS ter	151bp	F：GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG R：CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T P：FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA

(注) F：フォワードプライマー、R：リバースプライマー、P：プローブ 

 

	名称	標的遺伝子	サイズ	遺伝子配列
1	ピーマンβ-fructosidase遺伝子配列検知プライマー対・プローブ	β-fructosidase	134bp	F(注)：CTG CCT CCG TCA AGA TTT GGT CAC T R：ATC TTG GAT TTC TTG ATG GGA CGG T P：VIC - GAT ATT CGA TCC TTC CCA - MGB
2	35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ	P35S	101bp	F：ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T R：CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T P：FAM- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -TAMRA
3	NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ	NOS ter	151bp	F：GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG R：CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T P：FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA

(注) F：フォワードプライマー、R：リバースプライマー、P：プローブ 

 

使用PCR機器及び反応条件

   1）検査法の開発・確立に使用したPCR機器

      ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus（いずれもアプライドバイオシステムズ社）

   2）反応条件

      50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 45cycles

   3）PCR試薬

      Taqman Universal PCR Master Mix

  

妥当性確認 

GM濃度(%)	試料数	正答率(%)(注1)	誤答率(%)(注2)
0.5%	56	100%	0%
0.1%	56	98.2%	1.8%
0%	56	100%	0%

 

GM濃度(%)	試料数	正答率(%)(注1)	誤答率(%)(注2)
0.5%	56	100%	0%
0.1%	56	96.4%	3.6%
0%	56	100%	0%

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、0.1及び0.5%の試料については陽性と判断した比率を示す。 

(注2) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、0.1及び0.5%の試料については偽陰性率を示す。

 

検出下限

   0.1%

 

農林水産省事業名

 検査手順作成：平成23年度遺伝子組換え農作物リスク管理強化事業

 共  同  試  験 ：平成26年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業

                              （栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業）

 

References