栽培用タマネギ種子における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法はタマネギの種子を対象とする。GM quicker 2（NIPPON GENE社）を用い、1検体から2反復でDNAを抽出・精製する。得られたDNA試料液を、内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRに供し、内在性遺伝子と組換え体由来遺伝子の検出の可否により、遺伝子組換え体の含有の有無を判定する。

2. 検査法

栽培用タマネギ種子における遺伝子組換え体の検査方法(PDF : 291KB)

3. 個別事項の説明

検査対象

和名: タマネギ
学名: Allium cepa

DNA抽出精製

NIPPON GENE社のGM quicker 2を使用。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	サイズ	遺伝子配列 (注)
1	35Sプロモータ配列検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)	P35S	101bp	F：5’- ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T -3’ R：5’- CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T -3’ P：FAM 5’- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -3’ MGB
2	NPTII配列検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)	NPTII	786bp	F：5’- GAC AGG TCG GTC TTG ACA AAA AG -3’ R：5’- GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC -3’ P：FAM 5’- CCC TGC GCT GAC AGC CGG A -3’ TAMRA
3	タマネギ内在性遺伝子検知プライマー対・プローブ (内在性遺伝子検出用)	Sat 1	200bp	F：5’- GAT CGG TGA AAC TGC AGT CAT AGG -3’ R：5’- CAT CGA TCA GAA CAA CAG ACC CTG -3’ P：FAM 5’- AGG GAA TAT CAG AAT CGG TGC TGG G -3’ TAMRA

(注) F：フォワードプライマー、R：リバースプライマー、P：プローブ

使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)、LightCycler 480 System（Roche社）

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix

妥当性確認

9試験機関による共同試験を実施。

各試験機関においては、3種類 (GM濃度0％、0.05％及び0.1％) の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度(％)	試料数	正答率(％)(注1）	誤答率(％)(注2)
0.1％	63	100％	0％
0.05％	63	100％	0％
0％	63	100％	0％

(注1) GM濃度が0％の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

(注2) GM濃度が0％の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限

0.05％

農林水産省事業名

平成24年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)
令和4年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
(栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者：組換え体管理指導班
代表：03-3502-8111（内線4510）
ダイヤルイン：03-6744-2102

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