担当:消費・安全局農産安全管理課
栽培用パパイヤ種子における遺伝子組換え体の検査法
1.概要
本検査法は、栽培用パパイヤの種子を検査対象とする。GM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体につき2反復でDNAを抽出精製する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することより、検体が遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-YK、PRSV-SC及びPRSV-HN)を含むか判定する。
2.検査法
栽培用パパイヤ種子における遺伝子組換え体の検査法(PDF:302KB)
3.個別事項の説明
検査対象農作物
和名: パパイヤ
学名: Carica papaya
DNA抽出精製
ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。
PCRプライマー対及びプローブ
1) PRSV-YK遺伝子組換え検知用
名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列(注) | |
1 |
遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-YK)検知試験用 |
YK-1 | 57bp |
F:GAT CCC CGG GTG GTC AGT R:CCG GTA TCC ACA GCT TCA TTT T P:FAM- AGA CGC CAT GGA AGG -MGB |
2 |
遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-YK)検知試験用 |
YK-2 | 76bp |
F:ACA CGG GGG ACT CTA GAG R:ACC GGT ATC CAC AGC TTC P:FAM- TCC CTT CCA TGG CGT C -TAMRA |
3 |
カリフラワーモザイクウイルス35S配列検知試験用 |
CaM | 82bp |
F:GCC TCT GCC GAC AGT GGT R:AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C P:FAM- CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G -TAMRA |
(注) F: フォワードプライマー、R: リバースプライマー、P: プローブ
2) PRSV-SC組換え遺伝子検知用
名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列 | |
1 |
遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-SC)検知試験用 (組換え体由来遺伝子検出用) |
SC | 70bp |
F:CAT TTC ATT TGG AGA GAA CAC G R:ACC AGC ATC CAC AGC TTC P:FAM- ACT CTA GAG GAT CCA TGT CCA A -TAMRA |
2 |
カリフラワーモザイクウイルス35S配列検知試験用 (組換え体由来遺伝子検出用) |
CaM | 82bp |
F:GCC TCT GCC GAC AGT GGT R:AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C P:FAM- CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G -TAMRA |
3) PRSV-HN組換え遺伝子検知用
標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列 | ||
1 |
遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-HN)検知試験用 (組換え体由来遺伝子検出用) |
HN | 174bp |
F:GAC GAG TAC AAG GAG ACG CC R:GTT GTC ACT GAA GCG GGA AG P:FAM- TGG CTG CTA TTG GGC GAA TCA ACT AC -BHQ1 |
2 |
カリフラワーモザイクウイルス35S配列検知試験用 (組換え体由来遺伝子検出用) |
CaM | 82bp |
F:GCC TCT GCC GAC AGT GGT R:AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C P:FAM- CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G -TAMRA |
4)パパイヤ内在性遺伝子検知用
名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列 | |
1 |
Chymopapain遺伝子検知試験用 (内在性遺伝子検出用) |
Chy | 73bp |
F:CCA TGC GAT CCT CCC A R:CAT CGT AGC CAT TGT AAC ACT AGC TAA P:FAM- TTC CCT TCA T(BHQ1)CC ATT CCC ACT CTT GAG A |
使用PCR機器及び反応条件
1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器
ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus (いずれもアプライドバイオシステムズ社)
2)反応条件
50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 50cycles
3)PCR試薬
Taqman Universal PCR Master Mix
妥当性確認
1) PRSV-YK
8試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関には各GM濃度につき7点、計21点のブラインド試料を配付。
GM 濃度(%) | 試料数 | 正答率(%) |
誤答率(%) |
0.5% | 56 | 100% | 0% |
0.1% | 56 | 100% | 0% |
0% | 56 | 100% | 0% |
(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、>0%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については疑陽性率、>0%の試料については偽陰性率を示す。
2) PRSV-SC
10試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関には各GM濃度につき8点、計24点のブラインド試料を配付。
GM 濃度(%) | 試料数 | 正答率(%)(注1) | 誤答率(%)(注2) |
1% | 80 | 100% | 0% |
0.5% | 80 | 100% | 0% |
0% | 80 | 100% | 0% |
(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、>0%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については疑陽性率、>0%の試料については偽陰性率を示す。
3) PRSV-HN
8試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関には各GM濃度につき7点、計21点のブラインド試料を配付。
GM 濃度(%) | 試料数 | 正答率(%)(注1) | 誤答率(%)(注2) |
0.5% | 56 | 100% | 0% |
0.1% | 55 | 98.2% | 1.8% |
0% | 56 | 100% | 0% |
(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、>0%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については疑陽性率、>0%の試料については偽陰性率を示す。
検出下限
1)PRSV-YK
0.1%
2) PRSV-SC
0.5%
3) PRSV-HN
0.1%
農林水産省事業名
1) PRSV-YK
検査手順作成:平成23年未承認遺伝子組換えパパイヤ事案への緊急措置により構築
共 同 試 験 :平成29年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)
2) PRSV-SC
検査手順作成:平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)実施のための予備試験
共 同 試 験 :平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)
2) PRSV-HN
共 同 試 験 :平成30年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)
参考文献
1)-1,2 Nakamura.K, Akiyama.H, Ohmori.K, Takahashi.Y, Takabatake.R, Kitta.K, Nakazawa.H, Kondo.K, and Teshima.R, Identification and Detection Method for Genetically Modified Papaya Resistant to Papaya Ringspot Virus YK Strain, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1648-1651
1)-3,2)-2 Qualitative duplex PCR method for detection of Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter and nopaline synthase terminator (partim CaMV P-35S), JRC Compendium of Reference Methods for GMO analysis
2)-1 Nakamura.K, Kondo.K, Kobayashi.T, Noguchi.A, Ohmori.K, Takabatake.R, Kitta.K, Akiyama.H, Teshima.R, and Nishimaki-Mogami.T, Identification and Detection of Genetically Modifed Papaya Resistant to Papaya Ringspot Virus Strains in Thailand, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2014, 37(1), 1-5
4)-1 Noguchi.A, Nakamura.K, Skata.K, Kobayashi.T, Akiyama.H, Kondo.K, and Teshima.R. Ohmori.K, Kasahara.M, Takabatake.R, Kitta.K, Interlaboratory Validation Strudy of an Event-Specific Real-time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Genetically Modified 55-1 Papaya, Journal of AOAC International, 2013, Vol.96, No.5
お問合せ先
消費・安全局農産安全管理課
担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX:03-3580-8592