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農林水産省

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担当:消費・安全局農産安全管理課

栽培用パパイヤ種子における遺伝子組換え体の検査法

 1.概要

本検査法は、栽培用パパイヤの種子を検査対象とする。GM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体につき2反復でDNAを抽出精製する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することより、検体が遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-YK、PRSV-SC及びPRSV-HN)を含むか判定する。

2.検査法

栽培用パパイヤ種子における遺伝子組換え体の検査法(PDF:302KB)

3.個別事項の説明

検査対象農作物

和名: パパイヤ
学名: Carica papaya

DNA抽出精製

   ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。

   緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

 

PCRプライマー対及びプローブ

1) PRSV-YK遺伝子組換え検知用

  名称
標的遺伝子
サイズ
遺伝子配列(注)
1

遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-YK)検知試験用
(組換え体由来遺伝子検出用)

YK-1
57bp

F:GAT CCC CGG GTG GTC AGT

R:CCG GTA TCC ACA GCT TCA TTT T

P:FAM- AGA CGC CAT GGA AGG -MGB

2

遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-YK)検知試験用
(組換え体由来遺伝子検出用)

YK-2
76bp

F:ACA CGG GGG ACT CTA GAG

R:ACC GGT ATC CAC AGC TTC

P:FAM- TCC CTT CCA TGG CGT C -TAMRA

3

カリフラワーモザイクウイルス35S配列検知試験用
(組換え体由来遺伝子検出用)

CaM
82bp

F:GCC TCT GCC GAC AGT GGT

R:AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C

P:FAM- CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G -TAMRA

(注) F: フォワードプライマー、R: リバースプライマー、P: プローブ

 

2) PRSV-SC組換え遺伝子検知用

  名称
標的遺伝子
サイズ
遺伝子配列
1

遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-SC)検知試験用

(組換え体由来遺伝子検出用)

SC 70bp

F:CAT TTC ATT TGG AGA GAA CAC G

R:ACC AGC ATC CAC AGC TTC

P:FAM- ACT CTA GAG GAT CCA TGT CCA A -TAMRA

2

カリフラワーモザイクウイルス35S配列検知試験用

(組換え体由来遺伝子検出用)

CaM 82bp

F:GCC TCT GCC GAC AGT GGT

R:AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C

P:FAM- CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G -TAMRA

3) PRSV-HN組換え遺伝子検知用

    標的遺伝子 サイズ
遺伝子配列
1

遺伝子組換えパパイヤ(PRSV-HN)検知試験用

(組換え体由来遺伝子検出用)

HN 174bp

F:GAC GAG TAC AAG GAG ACG CC

R:GTT GTC ACT GAA GCG GGA AG

P:FAM- TGG CTG CTA TTG GGC GAA TCA ACT AC -BHQ1

2

カリフラワーモザイクウイルス35S配列検知試験用

(組換え体由来遺伝子検出用)

CaM 82bp

F:GCC TCT GCC GAC AGT GGT

R:AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C

P:FAM- CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G -TAMRA

 

 

4)パパイヤ内在性遺伝子検知用

 

  名称 標的遺伝子
サイズ
遺伝子配列
1

Chymopapain遺伝子検知試験用

(内在性遺伝子検出用)

Chy 73bp

F:CCA TGC GAT CCT CCC A

R:CAT CGT AGC CAT TGT AAC ACT AGC TAA

P:FAM- TTC CCT TCA T(BHQ1)CC ATT CCC ACT CTT GAG A

 

 

使用PCR機器及び反応条件

   1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

      ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus (いずれもアプライドバイオシステムズ社)

   2)反応条件

      50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 50cycles

   3)PCR試薬

      Taqman Universal PCR Master Mix

  

妥当性確認 

1) PRSV-YK 

5試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関にはGM陽性試料を3点あるいは6点、GM陰性試料を3点あるいは6点の計9点を、ブラインド試料として配付。

GM 濃度(%) 試料数 正答率(%)(注1) 誤答率(%)(注2)
1% 21 100% 0%
0% 24 100% 0%

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、>0%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については疑陽性率、>0%の試料については偽陰性率を示す。 

2) PRSV-SC

10試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関には各GM濃度につき8点、計24点のブラインド試料を配付。

GM 濃度(%) 試料数 正答率(%)(注1) 誤答率(%)(注2)
1% 80 100% 0%
0.5% 80 100% 0%
0% 80 100% 0%

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、>0%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については疑陽性率、>0%の試料については偽陰性率を示す。

3) PRSV-HN

8試験機関の参加による共同試験を実施。各試験機関には各GM濃度につき7点、計21点のブラインド試料を配付。

GM 濃度(%) 試料数 正答率(%)(注1) 誤答率(%)(注2)
0.5% 56 100% 0%
0.1% 55 98.2% 1.8%
0% 56 100% 0%

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、>0%の試料については陽性と判断した比率を示す。
(注2) GM濃度が0%の試料については疑陽性率、>0%の試料については偽陰性率を示す。

 

検出下限

1)PRSV-YK

1%

2) PRSV-SC

0.5%

3) PRSV-HN

0.1%

 

農林水産省事業名

1) PRSV-YK

 検査手順作成及び共同試験:平成23年未承認遺伝子組換えパパイヤ事案への緊急措置により構築

2) PRSV-SC

 検査手順作成:平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
                    (栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)実施のための予備試験

 共  同  試  験 :平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
                     (栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)

2) PRSV-HN

 共  同  試  験 :平成30年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
                     (栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)

参考文献

 1)-1,2 Nakamura.K, Akiyama.H, Ohmori.K, Takahashi.Y, Takabatake.R, Kitta.K, Nakazawa.H, Kondo.K, and Teshima.R, Identification and Detection Method for Genetically Modified Papaya Resistant to Papaya Ringspot Virus YK Strain, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1648-1651

 1)-3,2)-2  Qualitative duplex PCR method for detection of Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter and nopaline synthase terminator (partim CaMV P-35S), JRC Compendium of Reference Methods for GMO analysis

 2)-1  Nakamura.K, Kondo.K, Kobayashi.T, Noguchi.A, Ohmori.K, Takabatake.R, Kitta.K, Akiyama.H, Teshima.R, and Nishimaki-Mogami.T, Identification and Detection of Genetically Modifed Papaya Resistant to Papaya Ringspot Virus Strains in Thailand, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2014, 37(1), 1-5

 4)-1  Noguchi.A, Nakamura.K, Skata.K, Kobayashi.T, Akiyama.H, Kondo.K, and Teshima.R. Ohmori.K, Kasahara.M, Takabatake.R, Kitta.K, Interlaboratory Validation Strudy of an Event-Specific Real-time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Genetically Modified 55-1 Papaya, Journal of AOAC International, 2013, Vol.96, No.5

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課
担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX:03-3580-8592

 

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