栽培用イネ種子における遺伝子組換え体の検査法
1. 概要
本検査法は、イネの種子を対象とする。GM quicker 2（NIPPON GENE社）を用い、1検体から2反復でDNAを抽出・精製する。得られたDNA試料液を、内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRに供し、内在性遺伝子と組換え体由来遺伝子の検出の可否により、遺伝子組換え体の含有の有無を判定する。
2. 検査法
3. 個別事項の説明
検査対象
和名: イネ
学名: Oryza sativa
DNA抽出精製
NIPPON GENE社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。
PCRプライマー対及びプローブ
| 名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列 (注) | |
| 1 | 35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用) |
P35S | 101bp | F：5’- ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T -3’ R：5’- CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T -3’ P：FAM 5’- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -3’ MGB |
| 2 | NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用) |
NOS ter | 151bp | F：5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG -3’ R：5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’ P：FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA |
| 3 | イネ内在性遺伝子検知プライマー対・プローブ (内在性遺伝子検出用) |
PLD | 80bp | F：5’- GCT TAG GGA ACA GGG AAG TAA AGT T -3’ R：5’- CTT AGC ATA GTC TGT GCC ATC CA -3’ P：FAM 5’- TGA GTA TGA ACC TGC AGG TCG C -3’ TAMRA |
使用したPCR機器及び反応条件
1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器
Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)、LightCycler 480 System（Roche社）
2)反応条件
50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles
3)PCR試薬
Taqman Universal PCR Master Mix
妥当性確認
9試験機関による共同試験を実施。
各試験機関においては、3種類 (GM濃度0％、0.05％及び0.1％) の試料を、1濃度につき7点分析。
| GM濃度(％) | 試料数 | 正答率(％)(注1） | 誤答率(％)(注2) |
| 0.1％ | 63 | 100％ | 0％ |
| 0.05％ | 63 | 100％ | 0％ |
| 0％ | 63 | 100％ | 0％ |
検出下限
0.05％
農林水産省事業名
- 令和4年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
(栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)
お問合せ先
消費・安全局農産安全管理課
担当者：組換え体管理指導班
代表：03-3502-8111（内線4510）
ダイヤルイン：03-6744-2102
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