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農林水産省

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栽培用ペチュニア種子における遺伝子組換え体(F3’5’H及びZmA1)の検査法

1. 概要

本検査法は、ペチュニアの種子を対象とする。DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体(F3’5’H及びZmA1)を含むか判定する。

2. 検査法

3. 個別事項の説明

検査対象

和名: ツクバネアサガオ、ペチュニア
学名: Petunia x hybrida Vilm.


DNA抽出精製

QIAGEN社のDNeasy Plant Mini kitを使用。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

   名称  標的遺伝子  サイズ  遺伝子配列 (注)
1 35SプロモーターとF35Hの境界領域検知プライマー対・プローブ 
(組換え体由来遺伝子検出用)
P35Sp-F3’5’H   122bp F:5’- TTC ATT CGG AGA GGT ACG TAT TTT T -3

R:5’- CAC CAA GCT CAG TAA GTA GCA TCA TT -3’

P:FAM 5’- TTA CAT TCT ACA ACT ACA TCT AG -3’ MGB
2 F3'5'HとNOSターミネーター境界領域検知プライマー対・プローブ
(組換え体由来遺伝子検出用)
F3’5’H-NOSt   141bp F:5’- TGG TTA CTC CAA GGT TAC AAT TGG -3’

R:5’- GGC AAC AGG ATT CAA TCT TAA GAA A -3’

P:FAM 5’- CGA GCT CGA ATT TCC CCG ATC GTT -3’ TAMRA
3 35SプロモーターとZmA1の境界領域検知プライマー対・プローブ
(組換え体由来遺伝子検出用)
P35Sp-ZmA1   135bp F:5’- CGC AAG ACC CTT CCT CTA TAT AAG G -3’

R:5’- CCT CCC GCG TTT TTT TCT C -3’

P:FAM 5’- AGA ATT CCA GCT GCT CAC TCA GTC CTG C -3’ TAMRA
4 ペチュニア ブラシノイド受容体遺伝子配列検知プライマー対・プローブ
(内在性遺伝子検出用)
 BRI1   68bp F:5’- GGT GTC ACT TGA TCT CAG CTT TAA TT-3’

R:5’- TTG ACA ATG ACC CCA AGC TAG A-3’

P:FAM 5’- TTT GAC TGA GAG AAT ACC-3’ MGB
(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ


使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 


妥当性確認

9試験機関による共同試験を実施。

1試験機関においては、3種類 (GM濃度0%、0.05%及び0.1%) の試料を、1濃度につき7点分析。

 GM濃度(%)  試料数  正答率(%)(注1)  誤答率(%)(注2)
 0.1%  63  100%  0%
 0.05%  55  100%  0%
 0%  63  100%  0%   

 (注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

 (注2) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。


検出下限


0.05%

農林水産省事業名

  • 平成30年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
    (栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)
  • 令和3年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
    (栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX番号:03-3580-8592

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