栽培用ペチュニア種子における遺伝子組換え体（F3’5’H及びZmA1）の検査法

1. 概要

本検査法は、ペチュニアの種子を対象とする。DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体（F3’5’H及びZmA1）を含むか判定する。

2. 検査法

栽培用ペチュニア種子における遺伝子組換え体（F3’5’H及びZmA1）の検査方法(PDF : 254KB)

3. 個別事項の説明

検査対象

和名: ツクバネアサガオ、ペチュニア
学名: Petunia x hybrida Vilm.

DNA抽出精製

QIAGEN社のDNeasy Plant Mini kitを使用。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	サイズ	遺伝子配列 (注)
1	35SプロモーターとF3’5’Hの境界領域検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)	P35Sp-F3’5’H	122bp	F：5’- TTC ATT CGG AGA GGT ACG TAT TTT T -3’ R：5’- CAC CAA GCT CAG TAA GTA GCA TCA TT -3’ P：FAM 5’- TTA CAT TCT ACA ACT ACA TCT AG -3’ MGB
2	F3'5'HとNOSターミネーター境界領域検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)	F3’5’H-NOSt	141bp	F：5’- TGG TTA CTC CAA GGT TAC AAT TGG -3’ R：5’- GGC AAC AGG ATT CAA TCT TAA GAA A -3’ P：FAM 5’- CGA GCT CGA ATT TCC CCG ATC GTT -3’ TAMRA
3	35SプロモーターとZmA1の境界領域検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)	P35Sp-ZmA1	135bp	F：5’- CGC AAG ACC CTT CCT CTA TAT AAG G -3’ R：5’- CCT CCC GCG TTT TTT TCT C -3’ P：FAM 5’- AGA ATT CCA GCT GCT CAC TCA GTC CTG C -3’ TAMRA
4	ペチュニアブラシノイド受容体遺伝子配列検知プライマー対・プローブ (内在性遺伝子検出用)	BRI1	68bp	F：5’- GGT GTC ACT TGA TCT CAG CTT TAA TT-3’ R：5’- TTG ACA ATG ACC CCA AGC TAG A-3’ P：FAM 5’- TTT GAC TGA GAG AAT ACC-3’ MGB

(注) F：フォワードプライマー、R：リバースプライマー、P：プローブ

使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix

妥当性確認

9試験機関による共同試験を実施。

1試験機関においては、3種類 (GM濃度0％、0.05％及び0.1％) の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度(％)	試料数	正答率(％)(注1）	誤答率(％)(注2)
0.1％	63	100％	0％
0.05％	55	100％	0％
0％	63	100％	0％

(注1) GM濃度が0％の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

(注2) GM濃度が0％の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限

0.05％

農林水産省事業名

平成30年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
(栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)
令和3年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
(栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者：組換え体管理指導班
代表：03-3502-8111（内線4510）
ダイヤルイン：0367442102

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