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農林水産省

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栽培用サトウキビ種子及び地上部における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法は、サトウキビの種子及び地上部を対象とする。GM quicker 2 (NIPPON GENE社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2. 検査法

3. 個別事項の説明

検査対象

和名: サトウキビ
学名: Saccharum officinarum L.


DNA抽出精製

NIPPON GENE社のDNeasy Plant Mini kitを使用(※)。
(※)DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN社)を使用しDNA抽出することも可能。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

   名称  標的遺伝子  サイズ  遺伝子配列 (注)
1
NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ 
(組換え体由来遺伝子検出用)[1]
NOS ter   151bp F:5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3’

R:5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’

P:FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA
2
NPTII遺伝子配列検知プライマー対・プローブ 
(組換え体由来遺伝子検出用)[1]
NPTII   786bp F:5’- GAC AGG TCG GTC TTG ACA AAA AG-3’

R:5’- GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC -3’

P:FAM 5’- CCC TGC GCT GAC AGC CGG A -3’ TAMRA
3 植物共通遺伝子配列検知プライマー対・プローブ
(内在性遺伝子検出用)[1]
18S rRNA   111bp F:5’- TGT TGG CCT TCG GGA TCG GGA TCG GAG TA -3’

R:5’- GCT TTC GCA GTT GTT CGT CTT TCA-3’

P:FAM 5’- TCG GGG GCA TTC GTA TTT CAT AGT CAG A -3’ TAMRA
(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ


使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 


妥当性確認

  • 種子について
    8試験機関による共同試験を実施。

    1試験機関においては、3種類 (GM濃度0%、0.05%及び0.1%) の試料を、1濃度につき7点分析。

 GM濃度(%)(注1)  試料数  正答率(%)(注2)  誤答率(%)(注3)
 0.1%  56  100 %  0 %
 0.05%  55
 100 %  0 %
 0%  56  100 %  0 %   

 (注1) 35Sプロモーター及びNPTIIが導入された認証標準物質(MON87460 トウモロコシ)を該当濃度含有する。

 (注2) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

 (注3) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

 

  • 地上部について
    8試験機関による共同試験を実施。

    1試験機関においては、3種類 (GM濃度0%、0.05%及び0.1%) の試料を、1濃度につき7点分析。

 GM濃度(%)(注1)  試料数  正答率(%)(注2)  誤答率(%)(注3)
 0.1%  56  100 %  0 %
 0.05%  55
 100 %  0 %
 0%  56  100 %  0 %   

 (注1) 35Sプロモーター及びNPTIIが導入された認証標準物質(MON87460 トウモロコシ)を該当濃度含有する。

 (注2) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

 (注3) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。




検出下限


0.05%

農林水産省事業名


  • 令和2年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
    (栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

参考資料

[1] Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui and Kazumi Kitta, 
Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1), 26-37

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX番号:03-3580-8592

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