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農林水産省

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担当:消費・安全局農産安全管理課

栽培用ワタ種子における遺伝子組換え体の検査法

 1.概要

本検査法は、ワタの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2.検査法

栽培用ワタ種子における遺伝子組換え体の検査法(PDF:223KB)

3.個別事項の説明

検査対象

和名:ワタ
学名:Gossypium hirsutum L.

DNA抽出精製

   ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。

  緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

 

PCRプライマー対及びプローブ

  名称 標的遺伝子 サイズ 遺伝子配列
1 ワタSAH7遺伝子配列検知プライマー対・プローブ Sah7 115bp

F(注):AGT TTG TAG GTT TTG ATG TTA CAT TGA G

R:GCA TCT TTG AAC CGC CTA CTG

P:FAM- AAA CAT AAA ATA ATG GGA ACA ACC ATG ACA TGT -TAMRA

2 35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ P35S 101bp

F:ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T

R:CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T

P:FAM- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -TAMRA

3 NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ NOS ter 151bp

F:GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG

R:CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T

P:FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA

(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ 

 

使用PCR機器及び反応条件

   1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

      ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus(いずれもアプライドバイオシステムズ社)

   2)反応条件

      50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 45cycles

   3)PCR試薬

      Taqman Universal PCR Master Mix

  

妥当性確認 

8試験機関にて実施。

GM濃度(%) 試料数 正答率(%)(注1) 誤答率(%)(注2)
0.5% 56 100% 0%
0.1% 56 100% 0%
0% 56 100% 0%

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、0.1及び0.5%の試料については陽性と判断した比率を示す。 

(注2) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、0.5%の試料については偽陰性率を示す。

 

検出下限

   0.1%

 

農林水産省事業名

 検査手順作成:平成25年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業

                              (栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)

 共  同  試  験 :平成26年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業

                              (栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業(ナス等検証試験参画))

 

References

1 JRC Compendium of Reference Methods for GMO analysis

 Mazzara.M, Larcher.S, Savini.C, Charles Delobel.C, and Van Den Eede.G

"Event-Specific Methods for the Quantitation of the Hybrid Cotton Line 281-24-236/3006-210-23 Using Real-Time PCR - Validation Report and Protocol - DNA Extraction Cotton Seeds"

2,3 Journal of AOAC International, Volume 85, Number 5, September 2002, pp. 1077-1089(13)

 Kuribara.H, Shindo.Y, Matsuoka.T, Takubo.K, Futo.S, Aoki.N, Hirao.T, Akiyama.H, Goda.Y, Toyada.M, Hino.A

"Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean."

 

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課
担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX:03-3580-8592

 

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