栽培用クリーピングベントグラス種子における遺伝子組換え体のスクリーニング検査法

1. 概要

本検査法は栽培用のクリーピングベントグラスの種子を対象とする。GenCheck（ファスマック社）を用い、1検体から2反復でDNAを抽出する。得られたDNA試料液を、内在性遺伝子検出用プライマーセット及び組換え体由来遺伝子検出用プライマーセットを用いた蛍光LAMPに供し、内在性遺伝子と組換え体由来遺伝子の検出の可否により、遺伝子組換え体の含有の有無を判定する。なお、本検査法は、遺伝子組換え体のスクリーニング検査であることから、遺伝子組換え体陽性と判定した試料は、既存のリアルタイムPCR法を用いた検査法により確定診断を行う。

2. 検査法

• 栽培用クリーピングベントグラス種子における遺伝子組換え体のスクリーニング検査法(PDF : 360KB)

3. 個別事項の説明

検査対象

和名：クリーピングベントグラス
学名：Agrostis.stolonifera L.

DNA抽出精製

ファスマック社のGenCheckを使用。

PCRプライマー対及びプローブ

	名称	標的遺伝子	遺伝子配列（注）
1	35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ[1]	P35S	P35S-F3：5’- ATT GCG ATA AAG GAA AGG CTA TCG -3’ P35S-B3：5’- ACT TCC TTA TAT AGA GGA AGG GTC -3’ P35S-FIP：5’- GAA GAC GTG GTT GGA ACG TCT TCT TAG TGG TCC CAA AGA TGG A -3’ P35S-BIP：5’- GCA AGT GGA TTG ATG TGA TAT CTC CTT GCG AAG GAT AGT GGG A -3’ P35S-LoopF：5’- TTT CCA CGA TGC TCC TCG -3’ P35S-LoopB：5’- CGT AAG GGA TGA CGC ACA -3’
2	NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ[2]	NOS ter	TNOS-F3：5’- CGC GAT AAT TTA TCC TAG TTT G-3’ TNOS-B3：5’- CGT TCA AAC ATT TGG CAA T -3’ TNOS-FIP：5’- GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT TTT TCG CGC TAT ATT TTG TTT TCT A -3’ TNOS-BIP：5’- CAT GCT TAA CGT AAT TCA ACA TTT TTG AAT CCT GTT GCC GGT C -3’ TNOS-LoopF：5’- GAT TAG AGT CCC GCA ATT ATA C -3’ TNOS-LoopB：5’- AAA TTA TAT GAT AAT CAT CGC AA -3’
3	植物共通遺伝子配列検知プライマー対・プローブ[3]	18S rRNA	18SrRNA-F3：5’- CTC GGC AAC GGA TAT CTC G -3’ 18SrRNA-B3：5’- TAC CCG ATG AGG GTG TGG -3’ 18SrRNA-FIP：5’- TGG TTC GCG GGA TTC TGC AAT TTC TCG CAT CGA TGA AGA ACG -3’ 18SrRNA-BIP：5’- AGT CTT TGA ACG CAA GTT GCG CAG CGT GTT TTG CGT GAC G -3’ 18SrRNA-LoopF：5’- CAC ACC AGG TAT CGC ATT TCG -3’ 18SrRNA-LoopB：5’- CGA GGC CAT TCG GCT GA -3’

（注）F3：F3プライマー、B3：B3プライマー、FIP：フォワードインナープライマー、BIP：バックワードインナープライマー、LoopF：ループプライマーF、LoopB：ループプライマーB

使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用した機器

Applied Biosystems 7500、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (以上、Thermo Fisher Scientific社)、LightCycler 480 System（Roche社）

2)反応条件

 [64℃、30秒間] × 60cycles

↓ Ramp rate 1.6℃/s

95℃、15秒間

↓ Ramp rate 1.6℃/s

60℃、1分間

↓ Ramp rate 0.15℃/s

95℃、1秒間

3)LAMP試薬

Isothermal Master Mix 

妥当性確認

9試験機関による共同試験を実施。
各試験機関においては、3種類（GM濃度0％、0.5％及び1％）の試料を、1濃度につき7点分析。

GM濃度（％）（注1）	試料数	正答率（％）（注2）	誤答率（％）（注3）
1％	63	100％	0％
0.5％	63	100％	0％
0％	63	100％	0％

（注1）35Sプロモーターが導入された認証標準物質（MON88017 トウモロコシ）を該当濃度含有する。

（注2）GM濃度が0％の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

（注3）GM濃度が0％の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。

検出下限

0.5％

農林水産省事業名

• 令和5年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業（栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法確立事業）

参考資料

[1]Takabatake, R., Y. Kagiya, Y. Minegishi, S. Yeasmin, S. Futo, A.Noguchi, K. Kondo, J. Mano and K. Kitta (2018)
    Development and evaluation of rapid screening detection methods for genetically modified crops using loop-mediated isothermal amplification.
    Food Chem. 252: 390-396.
[2]Hardinge, P., G. Kiddle, L. Tisi and J. A. H. Murray (2018)
    Optimised LAMP allows single copy detection of 35Sp and NOSt in transgenic maize using Bioluminescent Assay in Real Time(BART).
    Sci.Rep. 8, 17590 (online), available from <https://doi.org/ 10.1038/s41598-018-36207-4>, (accessed_2021-6-30).
[3]南田 佳祐,堀 佑太朗,井上 佳美,金野 亜紀,平林 千鶴,川㟢 和実
    クリーピングベントグラス種子での簡易抽出法と蛍光LAMP 法を組み合わせた迅速なLMO検査法の検討
    植物防疫所調査研究報告(植防研報)第58 号：31 ～34 令和4年(2022)