栽培用メロン種子における遺伝子組換え体の検査法
1. 概要
本検査法は、メロンの種子を対象とする。DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。
2. 検査法
3. 個別事項の説明
検査対象
和名: メロン
学名: Cucumis melo L.
DNA抽出精製
QIAGEN社のDNeasy Plant Mini Kitを使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。
PCRプライマー対及びプローブ
| 名称 | 標的遺伝子 | サイズ | 遺伝子配列 (注) | |
| 1 | 35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)[1] |
P35S | 101bp | F：5’- ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T -3’ R：5’- CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T -3’ P：FAM 5’- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -3’ TAMRFA |
| 2 | NPTII配列検知プライマー対・プローブ (組換え体由来遺伝子検出用)[1] |
NPTII | 786bp | F：5’- GAC AGG TCG GTC TTG ACA AAA AG -3’ R：’- GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC -3’ P：FAM 5’- CCC TGC GCT GAC AGC CGG A -3’ TAMRA |
| 3 | 植物共通遺伝子配列検知プライマー対・プローブ (内在性遺伝子検出用)[1] |
18S rRNA | 111bp | F：5’- TGT TGG CCT TCG GGA TCG GGA TCG GAG TA-3’ R：5’- GCT TTC GCA GTT GTT CGT CTT TCA-3’ P：FAM 5’- TCG GGG GCA TTC GTA TTT CAT AGT CAG A -3’ TAMRA |
使用したPCR機器及び反応条件
1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器
Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)
2)反応条件
50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、15秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles
3)PCR試薬
Taqman Universal PCR Master Mix
妥当性確認
8試験機関による共同試験を実施。
1試験機関においては、3種類 (GM濃度0％、0.05％及び0.1％) の試料を、1濃度につき7点分析。
| GM濃度(％)(注1) | 試料数 | 正答率(％)(注2） | 誤答率(％)(注3) |
| 0.1 ％ | 56 | 100 ％ | 0 ％ |
| 0.05 ％ | 56 | 100 ％ | 0 ％ |
| 0 ％ | 56 | 100 ％ | 0 ％ |
(注2) GM濃度が0％の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。
検出下限
0.05％
農林水産省事業名
- 平成31年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
(栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)
参考資料
[1] Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui and Kazumi Kitta,お問合せ先
消費・安全局農産安全管理課
担当者：組換え体管理指導班
代表：03-3502-8111（内線4510）
ダイヤルイン：03-6744-2102
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