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農林水産省

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栽培用ササゲ及びインゲンマメ種子における遺伝子組換え体の検査法

1.概要

 本検査法は、栽培用ササゲ及びインゲンマメの種子を検査対象とする。DNA抽出精製はGM quicker 2(ニッポンジーン社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2.検査法

3.個別事項の説明

検査対象

和名:ササゲ
学名:Vigna unguiculata L. Walp.

和名:インゲンマメ
学名:Phaseolus vulgaris L.

DNA抽出精製

ニッポンジーン社のGM quicker 2を使用。
緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

1)ササゲ検査用

 

名称

標的遺伝子

サイズ

遺伝子配列

植物共通配列18S rRNA遺伝子配列検知プライマー対・プローブ

18S rRNA 2

111bp

F(注):TGT TGG CCT TCG GGA TCG GGA TCG GAG TA

R:GCT TTC GCA GTT GTT CGT CTT TCA

P:FAM- TCG GGG GCA TTC GTA TTT CAT AGT CAG A-TAMRA

2

35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ

P35S

101bp

F:ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T

R:CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T

P:FAM- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -TAMRA

3

NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ

NOS ter

151bp

F:GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG

R:CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T

P:FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA

(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ 

 

 2) インゲンマメ検査用

 

名称<

標的遺伝子

サイズ

遺伝子配列

1

インゲンマメ内在性PvSR2遺伝子配列検知プライマー対・プローブ

PvSR2

162bp

F(注):GTA GAG TTC ACG AAA GAA TAT AAT G

R:CAA TTC TTA GAA TGA AGG TTT TGC AC

P:FAM - AGA GTG TTC TCA AAT CAA CAA TTA GAA - MGB 

2

35Sプロモーター配列検知プライマー対・プローブ

P35S

101bp

F:ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T

R:CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T

P:FAM- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -TAMRA

3

NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ

NOS ter

151bp

F:GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG

R:CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T

P:FAM- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -TAMRA

(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ 

 

使用PCR機器及び反応条件

   1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

      ABI 7900HT、ABI 7600、Step One Plus(いずれもアプライドバイオシステムズ社)

   2)反応条件

      50℃, 2分間 → 95℃, 10分間 → [95℃, 15秒間 → 60℃, 1分間] × 45cycles

   3)PCR試薬

      Taqman Universal PCR Master Mix 

妥当性確認 

8試験機関にて実施。

1)ササゲ

GM濃度(%)

試料数

正答率(%) (注1)

誤答率(%) (注2)

0.1%

56

100%

0%

0.05%

56

100%

0%

0%

56

100%

0%

 

2)インゲンマメ

GM濃度(%)

試料数

正答率(%) (注1)

誤答率(%) (注2)

0.1%

56

100%

0%

0.05%

56

96.4%

3.6%

0%

56

100%

0%

(注1) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、0.1及び0.5%の試料については陽性と判断した比率を示す。 

(注2) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、0.1及び0.5%の試料については偽陰性率を示す。

検出下限

0.05%

 

農林水産省事業名

  • 検査手順作成:平成26年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法整備事業)
  • 共  同  試  験 :平成27年度輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策事業
(栽培用種子の未承認遺伝子組換え体検査法確立事業)

 

References

1)-1 Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 60, 2012, pp.4672-4677

Andr'eia Z. Dinon, F'abio C. A. Brod, Carla S. Mello, Edna M. M. Oliveira, Josias C. Faria and Ana C. M. Arisi

"Primers and Probes Dvelopment for Specific PCR Detection of Genetically Modified Common Bean(Phaseolus vulgaris) Embrapa 5.1"

2)-1 Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 57, 2009, pp.26-37

Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui and Kazumi Kitta

"Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan"

1,2)-2,3 Journal of AOAC International, Volume 85, Number 5, September 2002, pp. 1077-1089(13)

Kuribara.H, Shindo.Y, Matsuoka.T, Takubo.K, Futo.S, Aoki.N, Hirao.T, Akiyama.H, Goda.Y, Toyada.M, and Hino.A.

"Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean"

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX番号:03-3580-8592

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