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農林水産省

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栽培用トマト種子における遺伝子組換え体の検査法

1. 概要

本検査法は、トマトの種子を対象とする。GM quicker2 (NIPPON GENE社)を用い、1検体から2反復で実施する。抽出DNA試料中の目的遺伝子の有無を内在性遺伝子検出用プライマー対・プローブ及び組換え体由来遺伝子検出用プライマー対・プローブを用いたリアルタイムPCRで確認することにより、検体が遺伝子組換え体を含むか判定する。

2. 検査法

3. 個別事項の説明

検査対象

和名: トマト
学名: Solanum lycopersicum L.


DNA抽出精製

NIPPON GENE社のGM quicker2を使用。

緩衝液中に抽出したDNAをシリカゲル膜に吸着させ、不純物を取り除いた後、溶出。

PCRプライマー対及びプローブ

   名称  標的遺伝子  サイズ  遺伝子配列 (注)
1 35Sプロモータ配列検知プライマー対・プローブ
(組換え体由来遺伝子検出用)[1]
P35S 101bp F:5’- ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T -3’

R:5’- CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T -3’

P:FAM 5’- CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT -3’ TAMRA
2
NOSターミネーター配列検知プライマー対・プローブ 
(組換え体由来遺伝子検出用)[1]
NOS ter   151bp F:5’- GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3’

R:5’- CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T -3’

P:FAM 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA -3’ TAMRA
3 トマト内在性遺伝子(LAT52)検知プライマー対・プローブ
(内在性遺伝子検出用)[2]
LAT52   92bp F:5’- AGA CCA CGA GAA CGA TAT TTG C-3’

R:5’- TTC TTG CCT TTT CAT ATC CAG ACA-3’

P:FAM 5’- CTC TTT GCA GTC CTC CCT TGG GCT -3’ TAMRA
(注) F:フォワードプライマー、R:リバースプライマー、P:プローブ


使用したPCR機器及び反応条件

1)検査法の開発・確立に使用したPCR機器

Applied Biosystems 7900HT、Applied Biosystems 7500 、Applied Biosystems QuantStudio5 、Applied Biosystems StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific社)

2)反応条件

50℃、2分間 → 95℃、10分間 → [95℃、30秒間 → 60℃、1分間] × 45cycles

3)PCR試薬

Taqman Universal PCR Master Mix 


妥当性確認

8試験機関による共同試験を実施。

1試験機関においては、3種類 (GM濃度0%、0.05%及び0.1%) の試料を、1濃度につき7点分析。

 GM濃度(%)(注1)  試料数  正答率(%)(注2)  誤答率(%)(注3)
 0.1%  56  100 %  0 %
 0.05%  56  100 %  0 %
 0%  56  100 %  0 %   

 (注1) 35Sプロモーターが導入された認証標準物質(MON87460 トウモロコシ)を該当濃度含有する。。

 (注2) GM濃度が0%の試料については陰性と判断した比率、それ以外の濃度の試料については陽性と判断した比率を示す。

 (注3) GM濃度が0%の試料については偽陽性率、それ以外の濃度の試料については偽陰性率を示す。


検出下限


0.05%

農林水産省事業名

  • 平成23年度 遺伝子組換え農作物リスク管理強化事業
    (生物検査実施方法検討調査委託事業)
  • 平成31年度 輸入栽培用種子中の未承認遺伝子組換え体検査対策委託事業
    (栽培用種子の未承認遺伝組子換え体検査法整備及び確立事業)

参考資料

[1] Junichi Mano, Natsuki Shigemitsu, Satoshi Futo, Hiroshi Akiyama, Reiko Teshima, Akihiro Hino, Satoshi Furui and Kazumi Kitta, 
Real-Time PCR Array as a Universal Platform for the Detection of Genetically Modified Crops and Its Application in Identifying Unapproved Genetically Modified Crops in Japan, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1), 26-37
[2] Litao Yang, Aihu Pan, Junwei Jia, Jiayu Ding, Jianxiu Chen, Huang Cheng, Chengmei Zhang and Dabing Zhang, 
Validation of a Tomato-Specific Gene, LAT52, Used as an Endogenous Reference Gene in Qualitative and Real-Time Quantitative PCR Detection of Transgenic Tomatoes, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53, 183-190

お問合せ先

消費・安全局農産安全管理課

担当者:組換え体管理指導班
代表:03-3502-8111(内線4510)
ダイヤルイン:03-6744-2102
FAX番号:03-3580-8592

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